Margarete wurde 1522 in Flandern als Kind Kaiser Karls V. und der bürgerlichen Jeanne van den Gheynst geboren. Mit 14 Jahren verheiratete Karl seine Tochter mit Alexander de' Medici. Nur ein Jahr später übernahm sie nach der Ermordung ihres Gatten die Regierung in Florenz. Der 1538 geschlossenen Ehe mit Ottavio Farnese war kein Glück beschieden. Obwohl Karl seinem Schwiegersohn bei der Erlangung der Herzogswürde von Parma behilflich war, verbündete sich dieser später mit dem französischen König. Von 1556 an wurde der einzige Sohn Margaretes, Alexander Farnese, als Geisel für die politische Zuverlässigkeit seines Vaters am spanischen Hof erzogen. Nach ihrem Rücktritt als Generalstatthalterin der Niederlande zog sich Margarete 1567 nach Italien zurück. Auf Anregung Kardinal Granvelles versuchte Philipp II., die Herzogin nach der Pazifikation von Gent 1576 erneut mit der Landvogtei über die 17 Provinzen zu beauftragen. Die Zeit ihrer Regierung war den Niederländern, nicht zuletzt im Vergleich mit der des eisernen Herzogs, in guter Erinnerung geblieben. 1580 mußte ihr Sohn die Generalstatthalterschaft an seine Mutter abtreten, während er weiterhin den militärischen Oberbefehl ausübte. Das Problem der Machtaufteilung zwischen Margarete und Alexander blieb ungelöst und belastete die Verwaltung der Niederlande. Erst als Margarete 1583 mit Genehmigung von Philipp II. auf ihr Amt verzichtete, wurde der Dauerkonflikt mit ihrem Sohn beendet. 1586 verstarb die Herzogin von Parma in Italien.